OriGene社 CRISPR/Cas9ゲノム編集システム

OriGene社 CRISPR/Cas9ゲノム編集システム 

CRISPR/Cas9ゲノム編集システムは、ヒトU6ポリメラーゼIIIプロモーターから発現されるguide RNAとCas9タンパク質の共発現を必要とします。ゲノムDNA上のターゲット配列の3'末端側に存在するPAM配列（NGG）を目印として、Cas9タンパク質はターゲット配列に相補的なgRNA と複合体を形成してターゲット配列を認識し、PAM配列より上流の二本鎖DNAを切断します。切断されたゲノムDNAが修復・組換えされることを利用して、ノックアウトやノックインを作製することができます。

製品概要図 

製品ラインアップ

OriGene社では、guide RNAとCas9タンパク質を共発現するプラスミドベクターを提供しています。gRNAとCas9を共発現する基本的なスタンダードタイプの他、GFPモニタリング用、レンチウイルスベクター作製用、in vitroトランスクリプション用をラインアップしています。

スタンダードタイプ、GFPモニタリング用、レンチウイルスベクター作製用は、クローニング用に突出末端を持つようにあらかじめカットされたプレカットタイプ（線状化）と制限酵素BamH I/BsmB Iサイトを持つ環状プラスミドタイプの2種類から選択いただけます。

■ pCas-Guideベクター 

pCas-Guideベクターは、Cas9タンパク質のmRNAとgRNAを発現するスタンダードタイプのベクターです。

pCas-Guide Cloning Kit Cat # GE100001	pCas-Guide Cat # GE100002

■ pCas-Guide-GFPベクター

pCas-Guide-GFPベクターはCas9タンパク質、gRNAと共にGFPを発現するため、ベクターが挿入された細胞を蛍光で確認することができます。また、スタンダードタイプのpCas-Guideベクターとは異なり、Cas9タンパク質のC末端にはMyc/DDKタグが付加されます。 

pCas-Guide-GFP Cloning Kit Cat # GE100011	pCas-Guide-GFP Cat # GE100012

■ pLenti-Cas-Guideベクター 

pLenti-Cas-Guideベクターは第三世代レンチウイルスベクターで、初代培養細胞や幹細胞などの遺伝子導入が難しい細胞のゲノム編集に利用できます。また、スタンダードタイプのpCas-Guideベクターとは異なり、Cas9タンパク質のC末端にはMyc/DDKタグが付加されます。

pLenti-Cas-Guide Cloning Kit Cat # GE100009	pLenti-Cas-Guide Cat # GE100010

■ in vitroトランスクリプション

ノックアウト動物を作製するために、T7プロモーターで動くCRISP/Casシステムを利用して調製したCas9タンパク質のmRNAとgRNAを胚にインジェクションすることができます。Cas9 mRNAとgRNAは、in vitroトランスクリプションの手法を用いて、pT7-Cas9 vector、pT7-Guide vectorからそれぞれ調製できます。 

pT7-Guide Cat # GE100013	pT7-Cas9 Cat # GE100014

 

gRNAデザインツール 

• 無償のオンラインgRNAデザインツール
• ターゲット配列（20 bp）の候補を一覧で結果表示
• アンチセンスに対するターゲット配列もデザイン

https://wwws.blueheronbio.com/external/tools/gRNASrc.jsp  

使用例

pCas Guideシステムを用いたゲノム編集について、HEK293T細胞のHSP60タンパク質のC末端へのHAタグの挿入を例として紹介します。

■ 野生型HSP60配列（C末端）とHAタグ配列の挿入位置 

■ ターゲット配列の設計 

野生型HSP60タンパク質のC末端にHAタグを挿入するために、ストップコドン（TAA）付近にDNAの二本鎖切断を起こす必要があります。本システムは順方向配列（Forward targeting sequence）だけではなく逆相補鎖配列（Reverse complement sequence）も認識します。

・オンラインgRNAデザイン  

前頁で紹介したオンラインgRNAデザインツールを利用して、野生型HSP60遺伝子のストップコドン付近のターゲット配列を調べたところ、順方向配列と逆相補鎖配列に1つずつのターゲット配列があることがわかりました。

・ターゲット配列の位置 

■ pCas-Guideコンストラクトの作製  

オンラインgRNAデザインで調べたターゲット配列の結果をもとに、今回の実験では順方向配列および逆相補鎖配列をそれぞれpCas-Guideベクターに挿入して2種類のコンストラクトを作製しました。順方向のターゲット配列をpCas-HSP60T1、逆相補鎖配列をpCas-HSP60T2と呼びます。 

■ ドナーDNAの設計 

Cas9タンパク質によるターゲット配列の切断後、DNA修復の際の相同組換えを利用するためにドナーDNAが必要になります。今回の実験ではHAタグの塩基配列をHSP60遺伝子のストップコドン前後の約50 bpで挟んだドナーDNAを使用しました。

■ ゲノム編集プロトコール  

1. Day 1, Seed cells
Approximately 18–24 hours before transfection, seed HEK293T cells in a 6-well plate in 2.5 ml complete growth media per well. Ideally cells should be 50% confluent prior to transfection.

2. Day 2, Transfection
a. In a 1.5 ml tube, add 0.75 μg of pCas-Guide DNA and 0.75 μg of the HSP60 HA donor DNA. Add 60 μl of Opti-MEM to dilute the DNA by mixing completely.
b. Add 4.5 μl of transfection reagent（Turbofectin 8.0）to the diluted DNA mixture. Pipette gently to mix completely and incubate at RT for 20 min.
c. Transfer the Turbofectin 8.0/DNA mixture to a well in the 6-well plate prepared on day 1 drop-wise. Gently rock the plate back-and-forth and from side-to-side to achieve even distribution of the complexes.

3. Day 3
24hr post transfection, change the cell culture media with fresh media; grow cells at a CO2 incubator for an additional two days.

4. Day 5
Split the cells to three identical 6-well plates. Grow the cells for three more days.

5. Day 8
The cells can now be analyzed for genome editing.

■ ゲノム編集の確認 

ゲノム編集操作が終了したHEK293T細胞からライセートを調製し、抗HAタグ抗体および抗HSP60抗体を用いてウェスタンブロッティングを行いました。また、ゲノムDNAを抽出し、HAタグをコードするフォワードプライマーとドナー配列下流のHSP60遺伝子上にあるリバースプライマーを用いてPCRを行いました。これらの結果、HSP60タンパク質のC末端にHAタグが挿入されたことを確認しました。

FAQ 

Question： 20 bpのターゲット配列は、PAM配列（NGG）を伴っていることが必要とのことですが、NGG配列の位置は正確にこの20 bpの3'側にすぐ続く必要がありますか？
Answer： はい。NGG配列は20 bpのターゲット配列に隣接している必要があります。

Question： ターゲット特異的な20 bpの配列はどのように設計したらいいですか？
Answer： ターゲット特異的な配列は、PAM配列（NGG）と続いている必要があります。特異性を確保するためには、ターゲット配列20 bpのうち、PAM配列に近い側の12 bp（seed region）がそのゲノム中において特異的な配列である必要があります。BLAST検索などを行って確認してください。NGGまたはNAG配列に続く配列で、seed regionに3 bpより少ないミスマッチを含む配列は選択しないでください。

Question： 1つのゲノム編集プロジェクトに、いくつのターゲット配列を設計して試すべきですか？
Answer： gRNAの性質を完全に予測することはできませんので、OriGene社では2種類以上のターゲット配列を設計することを推奨しています。2種類以上のターゲット配列を使用することで、少なくとも1つの機能するターゲット配列を得ることができると思われます。

Question： ドナー配列に蛍光タンパク質や薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子がない場合、どのようにゲノム編集を解析したらいいですか？
Answer： その遺伝子が内在性のタンパク質と区別できるタンパク質をコードしている場合は、ウェスタンブロッティング法により確認できます。あるいは、PCRプライマーの一方をドナー配列中ともう片方をドナー配列の下流に設定して、ジャンクションPCRを行うことでも確認できます。

Question： pCasシステムのoff-target効果はどのように解決したらいいですか？
Answer： ターゲット配列を設計する際に、PAM配列に隣接した配列でミスマッチが3つより少ない配列が存在しないようなターゲット配列をBLAST検索で確認してください。NGGまたはNAG配列の前にターゲットでない配列がこないようにしてください。

Question： CF3シーケンシングプライマーはどのような配列ですか？
Answer： 5’ ACGATACAAGGCTGTTAGAGAG 3’

Question： pCas-Scramble はどのような配列ですか？
Answer： 5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3’

Question： pLentiベクターの安全性に関して、何か問題はありますか？
Answer： pLentiベクターは第三世代レンチウイルスベクターであり、両方のLTR（Long Terminal Repeat）が切り取られていますので最も安全性の高いレンチウイルスベクターです。もし不明なことがある場合は、pLentiベクターを使用される前に、施設内のバイオセーフティー担当部署へご確認ください。

Question： 第三世代レンチウイルスベクターの特徴は何ですか？
Answer： 第三世代レンチウイルスベクターは、第二世代レンチウイルスベクターよりも安全です。第三世代のパッケージングシステムは、1つのパッケージングベクターからgagとpolを発現し、もう1つのベクターからrevを発現します。第三世代のパッケージングシステムはtat（Trans-Activator of Transcription）を発現しません。

Question： レンチウイルスの生産にはどの細胞株を使ったらいいですか？
Answer： 一般的には HEK293T細胞が使用されます。レンチウイルス粒子を生産するためのHEK293T細胞は、ATCC（www.atcc.org）から入手することができます。

Question： pLentiベクターをウイルス作製のためではなく、direct transfectionに使用できますか？
Answer： OriGene社のpLentiベクターは、導入遺伝子を一過性で発現させるために使用することもできます。この方法ではトランスフェクション効率が低下しますので、通常はタンパク質の発現量が低くなります。

Question： pLentiベクターに第二世代パッケージングシステムを使用できますか？
Answer： OriGene社の第三世代pLentiベクターに、第二世代パッケージングシステムを組み合わせても機能すると推察します。ただし、OriGene社ではこの方法では試験を行っておりませんので、明確に可否を回答できません。pLentiベクターにはOriGene社Lenti-vpak Lentiviral Packaging Kit（cat.# TR30022）を使用することができます。

Question： pT7-Guideベクターに挿入されたターゲットの塩基配列はどのように確認できますか？
Answer： M13 forward primer, 5’ CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’を用いることで確認できます。

Webinar 

OriGene社WEBサイトに、CRISPR/Cas9ゲノム編集システムをテーマとしたWebinar（Webセミナー）の様子を録画した動画がアップロードされています。下記URLからアクセスしてください。

価格表

製品名	メーカー 製品番号	容量	価格	オンライン カタログ
pCas-Guide Cloning Kit	GE100001	1 kit	109,000
pCas-Guide	GE100002	1 kit	124,000
pCas-Guide-GFP Cloning Kit	GE100011	1 kit	109,000
pCas-Guide-GFP	GE100012	1 kit	124,000
pLenti-Cas-Guide Cloning Kit	GE100009	1 kit	109,000
pLenti-Cas-Guide	GE100010	1 kit	124,000
pT7-Guide	GE100013	10 μg	88,000
pT7-Cas9	GE100014	10 μg	88,000
pCas-Scramble	GE100003	10 μg	97,000
Annealing Buffer	GE100007	200 μl	20,000
CF3 Primer	GE100008	100 pmol	14,000

※記載の内容は、'14年2月現在の情報に基づいております。